Kiire saidile suunatud mutageneesikomplekt

Kiire ühe- või mitme saidi mutatsioon sihtgeeni sihtvektoris.

Kohapõhine mutagenees in vitro on oluline eksperimentaalne meetod erinevates bioloogia ja meditsiini valdkondades, mida kasutatakse enamasti sihtgeenide muutmiseks ja optimeerimiseks, promootorite reguleerimiskohtade uurimiseks, samuti valgu struktuuri ja funktsiooni keeruka seose uurimiseks. Komplekt kasutab praegust juhtivat tehnoloogiat, et viia otse läbi ühe saidi mutatsioon, mitme saidi mutatsioon, samuti sihtgeeni sisestamine või kustutamine. Ühe saidi mutatsiooni mutatsioonikiirus võib ulatuda üle 90%. Lisaks, erinevalt traditsioonilistest mutatsioonikomplektidest, mis nõuavad mitut PCR-vooru, subkloonimist ja muid aeganõudvaid ja töömahukaid samme, on komplekti toimimine lihtsam ja mutantse tüve konstrueerimiseks on vaja ainult nelja etappi.

Kass Ei	Pakendi suurus
44992901	20 rxn

Saatke meile e -kiri

Toote üksikasjad

KKK

Toote sildid

Funktsioonid

■ Lihtne ja kiire: komplektis kasutatakse ahelaga asendamata plasmiidi võimendustehnoloogiat. Metsikut tüüpi tüvest mutantseks tüveks üleminekuks on vaja ainult 4 etappi, ilma aeganõudvate ja töömahukate etappideta, nagu mitu PCR vooru ja subkloonimine.
■ Kõrge kasuteguriga praimer: Komplekt kasutab osaliselt kattuva praimeri disaini põhimõtet, nii et amplifitseerimise teel on võimalik saada rohkem mutantseid plasmiide.
■ Laialdaselt kasutatav: komplekt ei saa läbi viia mitte ainult ühe-, vaid ka mitmekohalist mutatsiooni. See võib muteerida kuni 5 saiti.
■ Tugev kohanemisvõime: Komplekt võib teostada kohapealseid mutatsioone maksimaalselt 10 kb suurustel plasmiididel, kattes põhimõtteliselt kõik tavaliselt kasutatavad plasmiidid.
■ Kõrge mutatsioonikiirus: komplekti ülesanne on metüleeritud plasmiidimallide kahekordne seedimine in vitro ja in vivo, tagades kõrgema mutatsioonikiiruse.

Saidimutatsioonireaktsiooni seadistus ja PCR-programm

■ Ühe praimeri mitme saidi mutatsiooni korral on mutatsioonikiirus madalam kui ühe saidi mutatsioonil, kuna mutatsioonikohti on rohkem. Meie katseandmete kohaselt vähendatakse mutatsioonipunktide arvu 5 -ni, kui mutatsioonikohtade arv jõuab 5 -ni. Seetõttu on sel juhul soovitatav suurendada kontrollitud kloonide arvu.
■ Komplekt toetab mitme praimeri mitme saidi mutatsiooni, nii et mutatsioonikatseid saab samaaegselt läbi viia laiemas geenivalikus. Mutatsioonikohtade arvu ülemine piir on endiselt 5.
■ Uute mutatsioonikatsete läbiviimisel on soovitatav kasutada komplektis olevaid kontrollplasmiide ja praimereid, et hõlbustada katseprobleemide analüüsi.

Fast Site-Directed Mutagenesis Kit

Kõiki tooteid saab kohandada ODM/OEM jaoks. Üksikasjade saamisekspalun klõpsake Kohandatud teenus (ODM/OEM)

Eelmine: Hiirekudede otsene PCR -komplekt

Järgmine: 2 × Pfu PCR segu

K: võimendusribasid pole

A-1 mall

■ Mall sisaldab valgu lisandeid või Taq inhibiitoreid jne - puhastage DNA matriits, eemaldage valgu lisandid või ekstraheerige matriitsi DNA puhastuskomplektidega.

■ Malli denatureerimine pole lõpule viidud - suurendage sobivalt denatureerimise temperatuuri ja pikendage denatureerimisaega.

■ Malli halvenemine-valmistage mall uuesti ette.

A-2 Primer

■ Praimerite halb kvaliteet-sünteesige praimer uuesti.

■ Praimeri lagunemine - säilitamiseks salvestage kõrge kontsentratsiooniga praimerid väikesesse kogusse. Vältige mitmekordset külmutamist ja sulatamist või pikaajalist külmumist 4 ° C juures.

■ Praimerite vale disain (nt praimeri pikkus ei ole piisav, praimerite vahele on tekkinud dimeer jne) -Praimerite ümberkujundamine (vältige praimeri dimeeri ja sekundaarse struktuuri teket)

A-3 Mg²⁺kontsentratsioon

■ Mg²⁺ kontsentratsioon on liiga madal - suurendage korralikult Mg²⁺kontsentratsioon: optimeerige Mg²⁺ kontsentratsioon reaktsioonide seeriaga vahemikus 1 mM kuni 3 mM intervalliga 0,5 mM, et määrata optimaalne Mg²⁺ kontsentratsioon iga malli ja praimeri kohta.

A-4 Lõõmutustemperatuur

■ Kõrge lõõmutamistemperatuur mõjutab praimeri ja matriitsi sidumist. —–Alandage lõõmutamistemperatuuri ja optimeerige seisundit 2 ° C gradiendiga.

A-5 Pikendusaeg

■ Lühike pikendusaeg - pikendamisaja pikendamine.

K: Valepositiivne

Nähtused: Negatiivsed proovid näitavad ka sihtjärjestuse ribasid.

A-1 PCR-i saastumine

■ Sihtjärjestuse või amplifikatsiooniproduktide ristsaastumine - Ärge püüdke sihtmärkjärjestust sisaldavat proovi pipeteerida negatiivse prooviga ega valage seda tsentrifuugitorust välja. Reaktiivid või seadmed tuleks autoklaavida olemasolevate nukleiinhapete kõrvaldamiseks ja saastumise olemasolu tuleks kindlaks teha negatiivsete kontrollkatsete abil.

■ Reagendi saastumine ——Alkoteerige reaktiivid ja hoidke madalal temperatuuril.

A-2 Primer

■ Mg²⁺ kontsentratsioon on liiga madal - suurendage korralikult Mg²⁺ kontsentratsioon: optimeerige Mg²⁺ kontsentratsioon reaktsioonide seeriaga vahemikus 1 mM kuni 3 mM intervalliga 0,5 mM, et määrata optimaalne Mg²⁺ kontsentratsioon iga malli ja praimeri kohta.

■ Ebaõige praimeri disain ja sihtjärjestus on homoloogia mittesihtjärjestusega. ——Projektide ümberkujundamine.

K: Mittespetsiifiline võimendus

Nähtused: PCR-i amplifikatsiooniribad on vastuolus eeldatava suurusega, kas suured või väikesed, või mõnikord esinevad nii spetsiifilised võimendusribad kui ka mittespetsiifilised amplifikatsiooniribad.

A-1 Primer

■ Praimeri halb spetsiifilisus

——Re-design primer.

■ Praimeri kontsentratsioon on liiga kõrge - suurendage denatureerimise temperatuuri ja pikendage denatureerimisaega.

A-2 Mg²⁺ kontsentratsioon

■ Mg²⁺ kontsentratsioon on liiga kõrge - vähendage õigesti Mg2+ kontsentratsiooni: optimeerige Mg²⁺ kontsentratsioon reaktsioonide seeriaga vahemikus 1 mM kuni 3 mM intervalliga 0,5 mM, et määrata optimaalne Mg²⁺ kontsentratsioon iga malli ja praimeri kohta.

A-3 Termostabiilne polümeraas

■ Liiga suur ensüümikogus - vähendage ensüümi kogust sobivalt 0,5 Ü intervalliga.

A-4 Lõõmutustemperatuur

■ Lõõmutamistemperatuur on liiga madal-suurendage sobivalt lõõmutamistemperatuuri või kasutage kaheastmelist lõõmutusmeetodit

A-5 PCR tsüklit

■ Liiga palju PCR -tsükleid - vähendage PCR -tsüklite arvu.

K: Laigulised või määrduvad ribad

A-1 Primer—— Halb spetsiifilisus —— Kavandage praimer uuesti, muutke praimeri asukohta ja pikkust, et suurendada selle spetsiifilisust; või teha pesastatud PCR.

A-2 malli DNA

——Mall ei ole puhas —— Puhastage mall või ekstraheerige DNA puhastuskomplektidega.

A-3 Mg²⁺ kontsentratsioon

- Mg²⁺ kontsentratsioon on liiga kõrge - vähendage õigesti Mg²⁺ kontsentratsioon: optimeerige Mg²⁺ kontsentratsioon reaktsioonide seeriaga vahemikus 1 mM kuni 3 mM intervalliga 0,5 mM, et määrata optimaalne Mg²⁺ kontsentratsioon iga malli ja praimeri kohta.

A-4 dNTP

—— dNTP -de kontsentratsioon on liiga kõrge —– vähendage sobivalt dNTP kontsentratsiooni

A-5 Lõõmutustemperatuur

——Liiga madal lõõmutamistemperatuur —– Tõsta lõõmutustemperatuuri sobivalt

A-6 tsüklit

—— Liiga palju tsükleid —— Optimeerige tsükli arvu

K: Kui palju matriitsi DNA -d tuleks lisada 50 μl PCR reaktsioonisüsteemi?

K: Kuidas pikki fragmente võimendada?

Esimene samm on valida sobiv polümeraas. Tavalist Taq polümeraasi ei saa korrigeerida 3'-5 'eksonukleaasi aktiivsuse puudumise tõttu ja mittevastavus vähendab tunduvalt fragmentide pikendamise efektiivsust. Seetõttu ei saa tavaline Taq polümeraas tõhusalt võimendada sihtfragmente, mis on suuremad kui 5 kb. Pikendamise efektiivsuse parandamiseks ja pika fragmendi võimendamise vajaduste rahuldamiseks tuleks valida spetsiaalse modifikatsiooniga Taq polümeraas või muu kõrge täpsusega polümeraas. Lisaks nõuab pikkade fragmentide võimendamine ka praimeri konstruktsiooni, denatureerimisaja, pikendamisaja, puhvri pH jms kohandamist. Tavaliselt võivad parema saagikusega kaasa tuua praimerid 18-24 bp. Malli kahjustuste vältimiseks tuleks denatureerimisaega 94 ° C juures lühendada 30 sekundini või vähem tsükli kohta ja temperatuuri tõusu aega 94 ° C -ni enne amplifikatsiooni vähem kui 1 minut. Veelgi enam, pikendustemperatuuri seadmine umbes 68 ° C ja pikendamisaja kavandamine vastavalt kiirusele 1 kb/min võib tagada pikkade fragmentide tõhusa amplifikatsiooni.

K: Kuidas parandada PCR amplifikatsiooni täpsust?

PCR -i amplifikatsiooni veamäära saab vähendada, kasutades erinevaid suure täpsusega DNA polümeraase. Kõigi seni leitud Taq DNA polümeraaside hulgas on Pfu ensüümil madalaim veamäär ja kõrgeim täpsus (vt lisatud tabelit). Lisaks ensüümide valikule saavad teadlased PCR -i mutatsioonikiirust veelgi vähendada, optimeerides reaktsioonitingimusi, sealhulgas puhvri koostise, termostabiilse polümeraasi kontsentratsiooni ja PCR -tsükli arvu optimeerimist.

Kirjutage oma sõnum siia ja saatke see meile