2 × Pfu PCR segu

Ülimalt puhas kõrge täpsusega Taq DNA polümeraas.

Pfu DNA polümeraasi ekspresseeritakse E. colist kloonitud Pyrococus Furiosis DNA polümeraasi geeniga ning see puhastatakse ja eraldatakse mitme kolonni puhastamisega. Kuna Pfu-l on 3'-5 'eksonukleaasi aktiivsus, saab seda korrigeerida DNA amplifikatsiooniprotsessis, samas kui traditsiooniline Taq DNA polümeraas seda ei tee. Kuigi teistel Taq DNA polümeraasidel nagu Vent, Deep Vent, Tli, UITma jne on korrektuurifunktsioonid, on Pfu -l kõigi seni leitud Taq DNA polümeraaside seas madalaim mittevastavuse määr. Pfu DNA polümeraasil on parem termiline stabiilsus kui tavalisel Taq DNA polümeraasil ja see suudab säilitada temperatuuril 95 ° C 1 tund rohkem kui 90% aktiivsust.

Ühetoru Pfu PCR segu (riiklik kõrgtehnoloogiline toote sertifikaat)

■ Pfu PCR Mix on parandanud PCR reaktsiooni spetsiifilisust ja tundlikkust ning võib võimendada keerulisi malle, millel on kõrge GC sisaldus, sekundaarne struktuur jms. Sihtmallist saab võimendada kuni 2 eksemplari, tagades täpsemad katsetulemused.

■ Ainulaadne Pfu MasterMix valem muudab kogu reaktsioonisüsteemi väga stabiilseks ning aktiivsust ei mõjuta korduv külmutamine-sulatamine ega pikaajaline säilitamine temperatuuril 4 ° C.

■ Stabiilne ja tõhus eelnevalt valmistatud PCR-segu lahendus võib muuta toimingu kiireks ja lihtsaks, vähendades oluliselt töömahukust ja proovivõtmisviga. Segusse on lisatud ka suure jõudlusega PCR-i võimendaja ja optimeerija, mis vähendab nõudeid PCR-tingimustele.

■ Sellel tootel on nii värve sisaldavad kui ka värvained. Värvaineid sisaldavaid PCR Mix tooteid saab pärast PCR-i otse elektroforeesida ilma proovipuhvrit lisamata.

Kass Ei	Pakendi suurus
4992780	1 ml
4992781	5*1 ml
4992782	1 ml
4992906	5*1 ml

Saatke meile e -kiri

Toote üksikasjad

Töövoog

KKK

Toote sildid

Tegevuse määratlus

1 ühiku (U) Pfu DNA polümeraasi aktiivsus on määratletud ensüümikogusena, mis on vajalik 10 nmol deoksünukleotiidide lisamiseks happes lahustumatutesse ainetesse temperatuuril 74 ° C 30 minuti jooksul, kasutades matriitsina/praimerina lõhe sperma aktiveeritud DNA-d.

Kvaliteedi kontroll

Puhtus SDS-PAGE tuvastamisel on üle 99%; Eksogeense nukleaasi aktiivsust ei tuvastata; Ühe koopia geeni inimese genoomis saab tõhusalt amplifitseerida; Nädala jooksul toatemperatuuril hoides ei muutu aktiivsus oluliselt.

Peamised tehnilised parameetrid

Sellel on 3'-5 'eksonukleaasi aktiivsus ja puudub 5'-3' eksonukleaasi aktiivsus. DNA amplifikatsiooni pikendamise kiirus on madalam kui Taq polümeraasil ja üldiselt on Pfu ensüümi pikendamise kiirus 0,5-1 kb minutis. Pfu termiline stabiilsus on parem kui Taq. Suure GC -sisaldusega šabloonide puhul võib denatureerimise temperatuuri tõsta 98 ° C -ni, mis ei mõjuta Pfu polümeraasi aktiivsust. PCR-produkt on nüriotsaline, millele võib lisada 3'-dA üleulatuvad osad enne TA vektoriga ligeerimist või kloonida nüri otsaga vektoriga

Rakendused

Seda saab kasutada DNA suure täpsusega amplifitseerimiseks, näiteks geeniekspressiooni kloonimiseks, saidile suunatud mutatsiooniks, ühe nukleotiidi polümorfismi (SNP) analüüsiks ja lõppparanduseks.

Kõiki tooteid saab kohandada ODM/OEM jaoks. Üksikasjade saamisekspalun klõpsake Kohandatud teenus (ODM/OEM)

Eelmine: Kiire saidile suunatud mutageneesikomplekt

Järgmine: Ultra HiFidelity PCR komplekt

1kb fragmendi võimendamiseks kasutage mallina genoomset DNA -d.
Pärast PCR reaktsiooni võtke elektroforeesi tuvastamiseks 5 μl.

K: võimendusribasid pole

A-1 mall

■ Mall sisaldab valgu lisandeid või Taq inhibiitoreid jne - puhastage DNA matriits, eemaldage valgu lisandid või ekstraheerige matriitsi DNA puhastuskomplektidega.

■ Malli denatureerimine pole lõpule viidud - suurendage sobivalt denatureerimise temperatuuri ja pikendage denatureerimisaega.

■ Malli halvenemine-valmistage mall uuesti ette.

A-2 Primer

■ Praimerite halb kvaliteet-sünteesige praimer uuesti.

■ Praimeri lagunemine - säilitamiseks salvestage kõrge kontsentratsiooniga praimerid väikesesse kogusse. Vältige mitmekordset külmutamist ja sulatamist või pikaajalist külmumist 4 ° C juures.

■ Praimerite vale disain (nt praimeri pikkus ei ole piisav, praimerite vahele on tekkinud dimeer jne) -Praimerite ümberkujundamine (vältige praimeri dimeeri ja sekundaarse struktuuri teket)

A-3 Mg²⁺kontsentratsioon

■ Mg²⁺ kontsentratsioon on liiga madal - suurendage korralikult Mg²⁺kontsentratsioon: optimeerige Mg²⁺ kontsentratsioon reaktsioonide seeriaga vahemikus 1 mM kuni 3 mM intervalliga 0,5 mM, et määrata optimaalne Mg²⁺ kontsentratsioon iga malli ja praimeri kohta.

A-4 Lõõmutustemperatuur

■ Kõrge lõõmutamistemperatuur mõjutab praimeri ja matriitsi sidumist. —–Alandage lõõmutamistemperatuuri ja optimeerige seisundit 2 ° C gradiendiga.

A-5 Pikendusaeg

■ Lühike pikendusaeg - pikendamisaja pikendamine.

K: Valepositiivne

Nähtused: Negatiivsed proovid näitavad ka sihtjärjestuse ribasid.

A-1 PCR-i saastumine

■ Sihtjärjestuse või amplifikatsiooniproduktide ristsaastumine - Ärge püüdke sihtmärkjärjestust sisaldavat proovi pipeteerida negatiivse prooviga ega valage seda tsentrifuugitorust välja. Reaktiivid või seadmed tuleks autoklaavida olemasolevate nukleiinhapete kõrvaldamiseks ja saastumise olemasolu tuleks kindlaks teha negatiivsete kontrollkatsete abil.

■ Reagendi saastumine ——Alkoteerige reaktiivid ja hoidke madalal temperatuuril.

A-2 Primer

■ Mg²⁺ kontsentratsioon on liiga madal - suurendage korralikult Mg²⁺ kontsentratsioon: optimeerige Mg²⁺ kontsentratsioon reaktsioonide seeriaga vahemikus 1 mM kuni 3 mM intervalliga 0,5 mM, et määrata optimaalne Mg²⁺ kontsentratsioon iga malli ja praimeri kohta.

■ Ebaõige praimeri disain ja sihtjärjestus on homoloogia mittesihtjärjestusega. ——Projektide ümberkujundamine.

K: Mittespetsiifiline võimendus

Nähtused: PCR-i amplifikatsiooniribad on vastuolus eeldatava suurusega, kas suured või väikesed, või mõnikord esinevad nii spetsiifilised võimendusribad kui ka mittespetsiifilised amplifikatsiooniribad.

A-1 Primer

■ Praimeri halb spetsiifilisus

——Re-design primer.

■ Praimeri kontsentratsioon on liiga kõrge - suurendage denatureerimise temperatuuri ja pikendage denatureerimisaega.

A-2 Mg²⁺ kontsentratsioon

■ Mg²⁺ kontsentratsioon on liiga kõrge - vähendage õigesti Mg2+ kontsentratsiooni: optimeerige Mg²⁺ kontsentratsioon reaktsioonide seeriaga vahemikus 1 mM kuni 3 mM intervalliga 0,5 mM, et määrata optimaalne Mg²⁺ kontsentratsioon iga malli ja praimeri kohta.

A-3 Termostabiilne polümeraas

■ Liiga suur ensüümikogus - vähendage ensüümi kogust sobivalt 0,5 Ü intervalliga.

A-4 Lõõmutustemperatuur

■ Lõõmutamistemperatuur on liiga madal-suurendage sobivalt lõõmutamistemperatuuri või kasutage kaheastmelist lõõmutusmeetodit

A-5 PCR tsüklit

■ Liiga palju PCR -tsükleid - vähendage PCR -tsüklite arvu.

K: Laigulised või määrduvad ribad

A-1 Primer—— Halb spetsiifilisus —— Kavandage praimer uuesti, muutke praimeri asukohta ja pikkust, et suurendada selle spetsiifilisust; või teha pesastatud PCR.

A-2 malli DNA

——Mall ei ole puhas —— Puhastage mall või ekstraheerige DNA puhastuskomplektidega.

A-3 Mg²⁺ kontsentratsioon

- Mg²⁺ kontsentratsioon on liiga kõrge - vähendage õigesti Mg²⁺ kontsentratsioon: optimeerige Mg²⁺ kontsentratsioon reaktsioonide seeriaga vahemikus 1 mM kuni 3 mM intervalliga 0,5 mM, et määrata optimaalne Mg²⁺ kontsentratsioon iga malli ja praimeri kohta.

A-4 dNTP

—— dNTP -de kontsentratsioon on liiga kõrge —– vähendage sobivalt dNTP kontsentratsiooni

A-5 Lõõmutustemperatuur

——Liiga madal lõõmutamistemperatuur —– Tõsta lõõmutustemperatuuri sobivalt

A-6 tsüklit

—— Liiga palju tsükleid —— Optimeerige tsükli arvu

K: Kui palju matriitsi DNA -d tuleks lisada 50 μl PCR reaktsioonisüsteemi?

K: Kuidas pikki fragmente võimendada?

Esimene samm on valida sobiv polümeraas. Tavalist Taq polümeraasi ei saa korrigeerida 3'-5 'eksonukleaasi aktiivsuse puudumise tõttu ja mittevastavus vähendab tunduvalt fragmentide pikendamise efektiivsust. Seetõttu ei saa tavaline Taq polümeraas tõhusalt võimendada sihtfragmente, mis on suuremad kui 5 kb. Pikendamise efektiivsuse parandamiseks ja pika fragmendi võimendamise vajaduste rahuldamiseks tuleks valida spetsiaalse modifikatsiooniga Taq polümeraas või muu kõrge täpsusega polümeraas. Lisaks nõuab pikkade fragmentide võimendamine ka praimeri konstruktsiooni, denatureerimisaja, pikendamisaja, puhvri pH jms kohandamist. Tavaliselt võivad parema saagikusega kaasa tuua praimerid 18-24 bp. Malli kahjustuste vältimiseks tuleks denatureerimisaega 94 ° C juures lühendada 30 sekundini või vähem tsükli kohta ja temperatuuri tõusu aega 94 ° C -ni enne amplifikatsiooni vähem kui 1 minut. Veelgi enam, pikendustemperatuuri seadmine umbes 68 ° C ja pikendamisaja kavandamine vastavalt kiirusele 1 kb/min võib tagada pikkade fragmentide tõhusa amplifikatsiooni.

K: Kuidas parandada PCR amplifikatsiooni täpsust?

PCR -i amplifikatsiooni veamäära saab vähendada, kasutades erinevaid suure täpsusega DNA polümeraase. Kõigi seni leitud Taq DNA polümeraaside hulgas on Pfu ensüümil madalaim veamäär ja kõrgeim täpsus (vt lisatud tabelit). Lisaks ensüümide valikule saavad teadlased PCR -i mutatsioonikiirust veelgi vähendada, optimeerides reaktsioonitingimusi, sealhulgas puhvri koostise, termostabiilse polümeraasi kontsentratsiooni ja PCR -tsükli arvu optimeerimist.

Kirjutage oma sõnum siia ja saatke see meile