Hiirekudede otsene PCR -komplekt

Sihtgeeni kiire amplifikatsioon otse loomakoe proovidest ilma ekstraheerimiseta.

Mouse Tissue Direct PCR Kit kasutab ainulaadset pakendikujundust, mis sisaldab kõiki reagendid kiireks genoomseks DNA valmistamiseks ja PCR amplifikatsiooniks. Seda saab kasutada üheastmelise genoomi DNA puhastamiseks hiire kudedest (saba, kõrv ja varvas) ning sellele järgneva PCR amplifikatsiooni ja tuvastamisega. Kogu protsess ei hõlma homogeniseerimist, purustamist, üleöö lagundamist, orgaanilise lahustiga ekstraheerimist, etanooli sadestamist ega kolonni puhastamise etappe. Stabiilseid tulemusi on võimalik saavutada lihtsate ja kiirete toimingutega.

Selle komplektiga kaasasolev 2 × Dir PCR MasterMix on väga ühilduv PCR reagent, mis suudab tõhusalt ja spetsiifiliselt amplifitseerida DNA -d, ilma et oleks vaja eemaldada selliseid lisandeid nagu valgud. See reagent sisaldab antikehaga modifitseeritud kuumkäivitustTaq DNA polümeraas, dNTP -d, MgCl₂, puhvrid, samuti PCR reaktsiooni võimendaja, optimeerija ja stabilisaator. PCR -reaktsiooni saab läbi viia, lisades lihtsalt ligikaudu ekstraheeritud matriitsi ja spetsiifilisi praimereid. Kogu protsess on kiire, lihtne, tundlik, spetsiifiline ja stabiilne, mis sobib eriti hästi suure läbilaskevõimega sõelumiseks. 2 × Dir PCR MasterMix sisaldab eelsegatud elektroforeesivärvi, nii et PCR -tooted saab pärast reaktsiooni otse elektroforeesi tuvastamiseks saata. PCR produkti 3 'otsal on A-saba, mida saab kasutada TA kloonimiseks.

Kass Ei	Pakendi suurus
4992531	20 µl × 50 rxn
4992532	20 µl × 200 rxn

Saatke meile e -kiri

Toote üksikasjad

Töövoog

Eksperimentaalne näide

KKK

Toote sildid

Funktsioonid

■ Lihtne ja kiire: genoomset DNA -d saab hiire kudedest kiiresti ekstraheerida 60 minutiga ilma vedela lämmastiku jahvatamise ja orgaanilise lahusti ekstraheerimiseta.
■ Lai kasutusala: sobib genoomse DNA üheastmeliseks ekstraheerimiseks hiire sabast, kõrvast, varbast ja muudest kudedest.
■ Kõrge spetsiifilisus: selles tootes kasutatav Taq polümeraas on antikehaga modifitseeritud kuum-start ensüüm, millel on kõrge matriitsi ja praimeri afiinsus ning amplifikatsioonispetsiifilisus, mis sobib eriti hästi genotüpiseerimiseks ja transgeenseks identifitseerimiseks.
■ Geenituvastus: toodet on lihtne kasutada usaldusväärsete tulemustega ning see sobib eriti hästi läbilaskevõime analüüsiks ja hiire kudede tuvastamiseks

Kõiki tooteid saab kohandada ODM/OEM jaoks. Üksikasjade saamisekspalun klõpsake Kohandatud teenus (ODM/OEM)

Eelmine: Blood Direct PCR komplekt

Järgmine: Kiire saidile suunatud mutageneesikomplekt

Experimental Example

Kasutades Mouse Tissue Direct PCR komplekti ja tarnija A asjakohast toodet, võimendades vastavalt 1000 bp, 2000 bp ja 3000 bp fragmente hiire sabast, hiire kõrvast ja roti sabast. Tulemus näitas, et Mouse Tissue Direct PCR Kit on spetsiifilisem ja edukam.

K: võimendusribasid pole

A-1 mall

■ Mall sisaldab valgu lisandeid või Taq inhibiitoreid jne - puhastage DNA matriits, eemaldage valgu lisandid või ekstraheerige matriitsi DNA puhastuskomplektidega.

■ Malli denatureerimine pole lõpule viidud - suurendage sobivalt denatureerimise temperatuuri ja pikendage denatureerimisaega.

■ Malli halvenemine-valmistage mall uuesti ette.

A-2 Primer

■ Praimerite halb kvaliteet-sünteesige praimer uuesti.

■ Praimeri lagunemine - säilitamiseks salvestage kõrge kontsentratsiooniga praimerid väikesesse kogusse. Vältige mitmekordset külmutamist ja sulatamist või pikaajalist külmumist 4 ° C juures.

■ Praimerite vale disain (nt praimeri pikkus ei ole piisav, praimerite vahele on tekkinud dimeer jne) -Praimerite ümberkujundamine (vältige praimeri dimeeri ja sekundaarse struktuuri teket)

A-3 Mg²⁺kontsentratsioon

■ Mg²⁺ kontsentratsioon on liiga madal - suurendage korralikult Mg²⁺kontsentratsioon: optimeerige Mg²⁺ kontsentratsioon reaktsioonide seeriaga vahemikus 1 mM kuni 3 mM intervalliga 0,5 mM, et määrata optimaalne Mg²⁺ kontsentratsioon iga malli ja praimeri kohta.

A-4 Lõõmutustemperatuur

■ Kõrge lõõmutamistemperatuur mõjutab praimeri ja matriitsi sidumist. —–Alandage lõõmutamistemperatuuri ja optimeerige seisundit 2 ° C gradiendiga.

A-5 Pikendusaeg

■ Lühike pikendusaeg - pikendamisaja pikendamine.

K: Valepositiivne

Nähtused: Negatiivsed proovid näitavad ka sihtjärjestuse ribasid.

A-1 PCR-i saastumine

■ Sihtjärjestuse või amplifikatsiooniproduktide ristsaastumine - Ärge püüdke sihtmärkjärjestust sisaldavat proovi pipeteerida negatiivse prooviga ega valage seda tsentrifuugitorust välja. Reaktiivid või seadmed tuleks autoklaavida olemasolevate nukleiinhapete kõrvaldamiseks ja saastumise olemasolu tuleks kindlaks teha negatiivsete kontrollkatsete abil.

■ Reagendi saastumine ——Alkoteerige reaktiivid ja hoidke madalal temperatuuril.

A-2 Primer

■ Mg²⁺ kontsentratsioon on liiga madal - suurendage korralikult Mg²⁺ kontsentratsioon: optimeerige Mg²⁺ kontsentratsioon reaktsioonide seeriaga vahemikus 1 mM kuni 3 mM intervalliga 0,5 mM, et määrata optimaalne Mg²⁺ kontsentratsioon iga malli ja praimeri kohta.

■ Ebaõige praimeri disain ja sihtjärjestus on homoloogia mittesihtjärjestusega. ——Projektide ümberkujundamine.

K: Mittespetsiifiline võimendus

Nähtused: PCR-i amplifikatsiooniribad on vastuolus eeldatava suurusega, kas suured või väikesed, või mõnikord esinevad nii spetsiifilised võimendusribad kui ka mittespetsiifilised amplifikatsiooniribad.

A-1 Primer

■ Praimeri halb spetsiifilisus

——Re-design primer.

■ Praimeri kontsentratsioon on liiga kõrge - suurendage denatureerimise temperatuuri ja pikendage denatureerimisaega.

A-2 Mg²⁺ kontsentratsioon

■ Mg²⁺ kontsentratsioon on liiga kõrge - vähendage õigesti Mg2+ kontsentratsiooni: optimeerige Mg²⁺ kontsentratsioon reaktsioonide seeriaga vahemikus 1 mM kuni 3 mM intervalliga 0,5 mM, et määrata optimaalne Mg²⁺ kontsentratsioon iga malli ja praimeri kohta.

A-3 Termostabiilne polümeraas

■ Liiga suur ensüümikogus - vähendage ensüümi kogust sobivalt 0,5 Ü intervalliga.

A-4 Lõõmutustemperatuur

■ Lõõmutamistemperatuur on liiga madal-suurendage sobivalt lõõmutamistemperatuuri või kasutage kaheastmelist lõõmutusmeetodit

A-5 PCR tsüklit

■ Liiga palju PCR -tsükleid - vähendage PCR -tsüklite arvu.

K: Laigulised või määrduvad ribad

A-1 Primer—— Halb spetsiifilisus —— Kavandage praimer uuesti, muutke praimeri asukohta ja pikkust, et suurendada selle spetsiifilisust; või teha pesastatud PCR.

A-2 malli DNA

——Mall ei ole puhas —— Puhastage mall või ekstraheerige DNA puhastuskomplektidega.

A-3 Mg²⁺ kontsentratsioon

- Mg²⁺ kontsentratsioon on liiga kõrge - vähendage õigesti Mg²⁺ kontsentratsioon: optimeerige Mg²⁺ kontsentratsioon reaktsioonide seeriaga vahemikus 1 mM kuni 3 mM intervalliga 0,5 mM, et määrata optimaalne Mg²⁺ kontsentratsioon iga malli ja praimeri kohta.

A-4 dNTP

—— dNTP -de kontsentratsioon on liiga kõrge —– vähendage sobivalt dNTP kontsentratsiooni

A-5 Lõõmutustemperatuur

——Liiga madal lõõmutamistemperatuur —– Tõsta lõõmutustemperatuuri sobivalt

A-6 tsüklit

—— Liiga palju tsükleid —— Optimeerige tsükli arvu

K: Kui palju matriitsi DNA -d tuleks lisada 50 μl PCR reaktsioonisüsteemi?

K: Kuidas pikki fragmente võimendada?

Esimene samm on valida sobiv polümeraas. Tavalist Taq polümeraasi ei saa korrigeerida 3'-5 'eksonukleaasi aktiivsuse puudumise tõttu ja mittevastavus vähendab tunduvalt fragmentide pikendamise efektiivsust. Seetõttu ei saa tavaline Taq polümeraas tõhusalt võimendada sihtfragmente, mis on suuremad kui 5 kb. Pikendamise efektiivsuse parandamiseks ja pika fragmendi võimendamise vajaduste rahuldamiseks tuleks valida spetsiaalse modifikatsiooniga Taq polümeraas või muu kõrge täpsusega polümeraas. Lisaks nõuab pikkade fragmentide võimendamine ka praimeri konstruktsiooni, denatureerimisaja, pikendamisaja, puhvri pH jms kohandamist. Tavaliselt võivad parema saagikusega kaasa tuua praimerid 18-24 bp. Malli kahjustuste vältimiseks tuleks denatureerimisaega 94 ° C juures lühendada 30 sekundini või vähem tsükli kohta ja temperatuuri tõusu aega 94 ° C -ni enne amplifikatsiooni vähem kui 1 minut. Veelgi enam, pikendustemperatuuri seadmine umbes 68 ° C ja pikendamisaja kavandamine vastavalt kiirusele 1 kb/min võib tagada pikkade fragmentide tõhusa amplifikatsiooni.

K: Kuidas parandada PCR amplifikatsiooni täpsust?

PCR -i amplifikatsiooni veamäära saab vähendada, kasutades erinevaid suure täpsusega DNA polümeraase. Kõigi seni leitud Taq DNA polümeraaside hulgas on Pfu ensüümil madalaim veamäär ja kõrgeim täpsus (vt lisatud tabelit). Lisaks ensüümide valikule saavad teadlased PCR -i mutatsioonikiirust veelgi vähendada, optimeerides reaktsioonitingimusi, sealhulgas puhvri koostise, termostabiilse polümeraasi kontsentratsiooni ja PCR -tsükli arvu optimeerimist.

Kirjutage oma sõnum siia ja saatke see meile