TIANSeq DNA kvantifitseerimiskomplekt (Illumina)

Praegu põhineb suure läbilaskevõimega sekveneerimistehnoloogia peamiselt järgmise põlvkonna sekveneerimistehnoloogial. Kuna järgmise põlvkonna sekveneerimistehnoloogia lugemispikkus on piiratud, peame jagama täispika järjestuse väikesteks fragmentide raamatukogudeks. Vastavalt erinevate sekveneerimiskatsete vajadustele valime tavaliselt ühe- või kahepoolse järjestuse. Praegu on järgmise põlvkonna sekveneerimisteegi DNA-fragmendid üldjuhul jaotunud vahemikus 200–800 aluspaari.

a) DNA on halva kvaliteediga ja sisaldab inhibiitoreid. Ensüümide aktiivsuse pärssimise vältimiseks kasutage kvaliteetseid DNA proove.

b) DNA proovi kogus on ebapiisav, kui kasutada PCR-vaba meetodit DNA raamatukogu loomiseks. Kui fragmenteeritud DNA sisend ületab 50 ng, saab raamatukogu ehitamise ajal valikuliselt läbi viia PCR-vaba töövoo. Kui raamatukogu koopiate arv on liiga madal, et seda otse sekveneerida, saab DNA raamatukogu pärast adapteri ligeerimist PCR abil amplifitseerida.

c) RNA saastumine viib ebatäpse esialgse DNA kvantifitseerimiseni RNA saastumine võib esineda genoomse DNA puhastusprotsessis, mis võib põhjustada DNA ebatäpse kvantifitseerimise ja ebapiisava DNA laadimise raamatukogu ehitamise ajal. RNA saab eemaldada, töödeldes RNaasiga.

A-1

a) Ilmuvad väikesed killud (60 bp-120 bp) Väikesed killud on tavaliselt adapterifragmendid või adapterite poolt moodustatud dimeerid. Puhastamine Agencourt AMPure XP magnethelmestega võib need adapterifragmendid tõhusalt eemaldada ja tagada järjestuse kvaliteedi.

b) Pärast PCR amplifikatsiooni ilmuvad raamatukokku suured fragmendid. Pärast adapteri ligeerimist suureneb raamatukogu DNA fragmendi suurus 120 bp võrra. Kui DNA fragment suureneb pärast adapteri ligeerimist rohkem kui 120 bp, võib selle põhjuseks olla PCR liigse amplifikatsiooni ebanormaalne fragmentide amplifikatsioon. PCR -tsüklite arvu vähendamine võib olukorda ära hoida.

c) Raamatukogu DNA fragmentide ebanormaalne suurus pärast adapteri ligeerimist Selle komplekti adapteri pikkus on 60 aluspaari. Kui fragmendi kaks otsa liidetakse adapteritega, suureneb pikkus ainult 120 bp võrra. Kui kasutate muud adapterit kui komplektis, võtke ühendust tarnijaga, et anda asjakohast teavet, näiteks adapteri pikkus. Veenduge, et katse töövoog ja toiming järgiks juhendis kirjeldatud samme.

d) Ebanormaalne DNA fragmendi suurus enne adapteri ligeerimist Selle probleemi põhjuseks võivad olla valed reaktsioonitingimused DNA killustumise ajal. Erineva DNA sisendi jaoks tuleks kasutada erinevaid reaktsiooniaegu. Kui DNA sisend on suurem kui 10 ng, soovitame optimeerimise algusajaks valida reaktsiooniaeg 12 minutit ja sel ajal toodetud fragmendi suurus jääb peamiselt vahemikku 300–500 aluspaari. Kasutajad saavad suurendada või vähendada DNA fragmentide pikkust 2-4 minutit vastavalt oma vajadustele, et optimeerida vajaliku suurusega DNA fragmente.

A-2

a) Killustamisaega pole optimeeritud Kui killustunud DNA on liiga väike või liiga suur, vaadake reaktsiooniaja määramiseks juhendis toodud juhiseid killustumisaja valimiseks ja kasutage seda ajapunkti kontrollina, seadistage lisaks reaktsioonisüsteemi, et pikendada või lühendada 3 minutit, et killustumisaega täpsemalt reguleerida.

A-3

DNA ebanormaalne jaotumine suuruses pärast killustumist

a) Fragmenteerimisreagendi vale sulatamismeetod või reaktiiv ei ole pärast sulatamist täielikult segunenud. Sulatage 5 × killustatuse ensüümisegu reagent jääl. Pärast sulatamist segage reaktiiv ühtlaselt, tuubi põhja õrnalt nipsutades. Ärge keevitage reaktiivi!

b) DNA sisendproov sisaldab EDTA -d või muid saasteaineid. Soolaioonide ja kelaativate ainete ammendumine DNA puhastamisetapis on katse õnnestumiseks eriti oluline. Kui DNA lahustatakse 1 × TE -s, kasutage killustamiseks juhendis esitatud meetodit. Kui EDTA kontsentratsioon lahuses on ebakindel, on soovitatav DNA puhastada ja lahustada see deioniseeritud vees järgnevaks reaktsiooniks.

c) Ebatäpne esialgne DNA kvantifitseerimine Fragmenteeritud DNA suurus on tihedalt seotud sisestatud DNA kogusega. Enne fragmenteerumist on DNA täpne kvantifitseerimine Qubiti, Picogreeni ja muude meetoditega hädavajalik, et määrata DNA täpne kogus reaktsioonisüsteemis.

 d) Reaktsioonisüsteemi ettevalmistamine ei järgi juhiseid Killustunud reaktsioonisüsteemi ettevalmistamine tuleb läbi viia jääl rangelt vastavalt juhistele. Parima efekti tagamiseks tuleb kõik reaktsioonikomponendid panna jääle ja reaktsioonisüsteem tuleb ette valmistada pärast täielikku jahutamist. Pärast valmistamise lõpetamist libistage või pipeteerige, et korralikult seguneda. Ärge keeristage!

1. Ebaõige segamismeetod (pööris, vägivaldne võnkumine jne) põhjustab raamatukogu fragmentide ebanormaalset levikut (nagu on näidatud järgmisel joonisel), mõjutades seega kogu kvaliteeti. Seetõttu tuleb fragmenteerimissegu reaktsioonilahuse valmistamisel pipeteerida õrnalt üles ja alla, et segada, või kasutada sõrmeotsaga, et libistada ja segada ühtlaselt. Olge ettevaatlik, et mitte segada keerisega.

2. Raamatukogu ehitamiseks tuleb kasutada kõrge puhtusastmega DNA -d

■ Hea DNA terviklikkus: elektroforeesi riba on üle 30 kb, ilma sabata

■ OD260/230:> 1,5

■ OD260/280: 1,7-1,9

3. DNA sisendkogus peab olema täpne DNA kvantifitseerimiseks soovitatakse kasutada Qubit ja PicoGreen meetodeid, mitte Nanodropi.

4. Tuleb määrata EDTA sisaldus DNA lahuses. EDTA -l on suur mõju killustumisreaktsioonile. Kui EDTA sisaldus on kõrge, tuleb DNA puhastada enne järgmist testi.

5. Killustamisreaktsiooni lahus tuleb valmistada jääl. Killustamisprotsess on tundlik reaktsiooni temperatuuri ja aja suhtes (eriti pärast võimendaja lisamist). Reaktsiooniaja täpsuse tagamiseks valmistage reaktsioonisüsteem ette jääl.

6. Killustamisreaktsiooniaeg peab olema täpne Fragmenteerimisetapi reaktsiooniaeg mõjutab otseselt fragmendiproduktide suurust, mõjutades seega DNA fragmentide suuruste jaotust raamatukogus.

1. Millist tüüpi proovi saab selle komplekti puhul rakendada?

Selle komplekti sobiv proovitüüp võib olla kogu RNA või puhastatud mRNA, millel on hea RNA terviklikkus. Kui kogu loomiseks kasutatakse kogu RNA -d, on soovitatav rRNA eemaldamiseks kõigepealt kasutada rRNA ammendumiskomplekti (Cat#4992363/4992364/4992391).

2. Kas selle komplektiga saab raamatukogu koostamiseks kasutada FFPE proove?

FFPE proovides olev mRNA laguneb teatud määral, suhteliselt halva terviklikkusega. Kui kasutate seda komplekti raamatukogu ehitamiseks, on soovitatav optimeerida killustatuse aega (lühendada killustumisaega või mitte teostada killustumist).

3. Mis võib põhjustada toote kasutusjuhendis esitatud suuruse valimise sammu, mis võib põhjustada sisestatud segmendi kergeid kõrvalekaldeid?

Suuruse valimisel tuleb rangelt järgida selle tootejuhendi suuruse valimise etappi. Kui esineb kõrvalekaldeid, võib põhjus olla selles, et magnethelmed ei ole toatemperatuuriga tasakaalus või ei ole täielikult segunenud, pipett pole täpne või vedelik jääb otsa. Katseks on soovitatav kasutada madala adsorptsiooniga näpunäiteid.

4. Adapterite valik raamatukoguehituses

Raamatukogu ehituskomplekt ei sisalda adapterreaktiivi ja seda komplekti on soovitatav kasutada koos TIANSeq üheindeksadapteriga (Illumina) (4992641/4992642/4992378).

5. Raamatukogu kvaliteedikontroll

Raamatukogu kvantitatiivne tuvastamine: raamatukogu massikontsentratsiooni ja molaarse kontsentratsiooni määramiseks kasutatakse Qubit ja qPCR. Toiming on rangelt kooskõlas toote kasutusjuhendiga. Raamatukogu kontsentratsioon vastab üldiselt NGS sekveneerimise nõuetele. Raamatukogu levikuulatuse tuvastamine: Agilent 2100 Bioanalyzer abil raamatukogu levikuulatus.

6. Võimendustsükli numbri valik

Vastavalt juhistele on PCR tsüklite arv 6-12 ja vajalike PCR tsüklite arv tuleks valida vastavalt proovisisendile. Suure saagikusega raamatukogudes esineb tavaliselt ülevõimendamist erineval määral, mis avaldub veidi suurema piigi järel sihtvahemiku tippu Agilent 2100 Bioanalyzer avastamisel või Qubiti tuvastatud kontsentratsioon on madalam kui qPCR. Kerge võimendus on normaalne nähtus, mis ei mõjuta raamatukogu sekveneerimist ja sellele järgnevat andmete analüüsi.

7. Naelu ilmub Agilent 2100 Bioanalyzer tuvastusprofiili

Agilent 2100 Bioanalüsaatori tuvastamisel on naelu ilmnenud proovide ebaühtlase killustatuse tõttu, kus teatud suuruses on rohkem fragmente ja see muutub selgemaks pärast PCR -i rikastamist. Sel juhul soovitatakse suuruse valikut mitte teha, st määrata fragmenteerumistingimuseks 94 ° C 15 min inkubeerimiseks, kus fragmentide jaotus on väike ja kontsentreeritud ning homogeensust saab parandada.