Metüülimis-spetsiifiline PCR (MSP) komplekt

Metüülimisspetsiifiline PCR tuvastuskomplekt.

Metüülimisspetsiifiline PCR (MSP) komplekt on spetsiaalselt välja töötatud klientidele, kes uurivad genoomse DNA metüleerimisomadusi PCR abil, milles MSP DNA polümeraas on termostabiilne polümeraas, mida on modifitseeritud antikehadega, ja 10 × MSP PCR puhver on PCR puhver, mis on optimeeritud spetsiaalselt MSP reaktsioon. See ühildub TIANGEN DNA bisulfiti teisenduskomplektiga (4992447).

Kass Ei Pakendi suurus
4992759 50 ettevalmistust

Toote üksikasjad

Töövoog

Eksperimentaalsed näited

KKK

Toote sildid

Funktsioonid

■ Toote eelised on kiirus, lihtsus, kõrge tundlikkus, tugev spetsiifilisus ja hea stabiilsus.

Spetsifikatsioon

Tüüp: MSP DNA polümeraas
Mall: <500 ng
Rakendused: See sobib metüülimisspetsiifilise PCR (MSP) meetodiga genoomse DNA metüülimisomaduste analüüsimiseks

Kõiki tooteid saab kohandada ODM/OEM jaoks. Üksikasjade saamisekspalun klõpsake Kohandatud teenus (ODM/OEM)


  • Eelmine:
  • Järgmine:

  • product_certificate04 product_certificate01 product_certificate03 product_certificate02
    ×

    1. Metüülimisspetsiifilist PCR (MSP) komplekti rakendati 400 aluspaari pikkuse fragmendi võimendamiseks, kasutades matriitsina bisulfiidiga töödeldud genoomset DNA-d, mille reaktsioonisüsteem oli 20 μl.

    Experimental Exampl

    2. PCR reaktsioonitsükli seadistamine

    Experimental Exampl

     

    Experimental Examples 1: tarnija A töödeldud proovid;
    2: Tarnija B töödeldud proovid;
    3: TIANGENiga töödeldud proov 4: NTC; M: D2000
    Experimental Examples 1-6:
    6 kordust;
    7: tarnija Töödeldud proov;
    8: NTC; Bio2-F/R ja P16-Me-F/R: kaks avastamispraimerit.
    K: võimendusribasid pole

    A-1 mall

    ■ Mall sisaldab valgu lisandeid või Taq inhibiitoreid jne - puhastage DNA matriits, eemaldage valgu lisandid või ekstraheerige matriitsi DNA puhastuskomplektidega.

    ■ Malli denatureerimine pole lõpule viidud - suurendage sobivalt denatureerimise temperatuuri ja pikendage denatureerimisaega.

    ■ Malli halvenemine-valmistage mall uuesti ette.

    A-2 Primer

    ■ Praimerite halb kvaliteet-sünteesige praimer uuesti.

    ■ Praimeri lagunemine - säilitamiseks salvestage kõrge kontsentratsiooniga praimerid väikesesse kogusse. Vältige mitmekordset külmutamist ja sulatamist või pikaajalist külmumist 4 ° C juures.

    ■ Praimerite vale disain (nt praimeri pikkus ei ole piisav, praimerite vahele on tekkinud dimeer jne) -Praimerite ümberkujundamine (vältige praimeri dimeeri ja sekundaarse struktuuri teket)

    A-3 Mg2+kontsentratsioon

    ■ Mg2+ kontsentratsioon on liiga madal - suurendage korralikult Mg2+ kontsentratsioon: optimeerige Mg2+ kontsentratsioon reaktsioonide seeriaga vahemikus 1 mM kuni 3 mM intervalliga 0,5 mM, et määrata optimaalne Mg2+ kontsentratsioon iga malli ja praimeri kohta.

    A-4 Lõõmutustemperatuur

    ■ Kõrge lõõmutamistemperatuur mõjutab praimeri ja matriitsi sidumist. —–Alandage lõõmutamistemperatuuri ja optimeerige seisundit 2 ° C gradiendiga.

    A-5 Pikendusaeg

    ■ Lühike pikendusaeg - pikendamisaja pikendamine.

    K: Valepositiivne

    Nähtused: Negatiivsed proovid näitavad ka sihtjärjestuse ribasid.

    A-1 PCR-i saastumine

    ■ Sihtjärjestuse või amplifikatsiooniproduktide ristsaastumine - Ärge püüdke sihtmärkjärjestust sisaldavat proovi pipeteerida negatiivse prooviga ega valage seda tsentrifuugitorust välja. Reaktiivid või seadmed tuleks autoklaavida olemasolevate nukleiinhapete kõrvaldamiseks ja saastumise olemasolu tuleks kindlaks teha negatiivsete kontrollkatsete abil.

    ■ Reagendi saastumine ——Alkoteerige reaktiivid ja hoidke madalal temperatuuril.

    A-2 Primer

    ■ Mg2+ kontsentratsioon on liiga madal - suurendage korralikult Mg2+ kontsentratsioon: optimeerige Mg2+ kontsentratsioon reaktsioonide seeriaga vahemikus 1 mM kuni 3 mM intervalliga 0,5 mM, et määrata optimaalne Mg2+ kontsentratsioon iga malli ja praimeri kohta.

    ■ Ebaõige praimeri disain ja sihtjärjestus on homoloogia mittesihtjärjestusega. ——Projektide ümberkujundamine.

    K: Mittespetsiifiline võimendus

    Nähtused: PCR-i amplifikatsiooniribad on vastuolus eeldatava suurusega, kas suured või väikesed, või mõnikord esinevad nii spetsiifilised võimendusribad kui ka mittespetsiifilised amplifikatsiooniribad.

    A-1 Primer

    ■ Praimeri halb spetsiifilisus

    ——Re-design primer.

    ■ Praimeri kontsentratsioon on liiga kõrge - suurendage denatureerimise temperatuuri ja pikendage denatureerimisaega.

    A-2 Mg2+ kontsentratsioon

    ■ Mg2+ kontsentratsioon on liiga kõrge - vähendage õigesti Mg2+ kontsentratsiooni: optimeerige Mg2+ kontsentratsioon reaktsioonide seeriaga vahemikus 1 mM kuni 3 mM intervalliga 0,5 mM, et määrata optimaalne Mg2+ kontsentratsioon iga malli ja praimeri kohta.

    A-3 Termostabiilne polümeraas

    ■ Liiga suur ensüümikogus - vähendage ensüümi kogust sobivalt 0,5 Ü intervalliga.

    A-4 Lõõmutustemperatuur

    ■ Lõõmutamistemperatuur on liiga madal-suurendage sobivalt lõõmutamistemperatuuri või kasutage kaheastmelist lõõmutusmeetodit

    A-5 PCR tsüklit

    ■ Liiga palju PCR -tsükleid - vähendage PCR -tsüklite arvu.

    K: Laigulised või määrduvad ribad

    A-1 Primer—— Halb spetsiifilisus —— Kavandage praimer uuesti, muutke praimeri asukohta ja pikkust, et suurendada selle spetsiifilisust; või teha pesastatud PCR.

    A-2 malli DNA

    ——Mall ei ole puhas —— Puhastage mall või ekstraheerige DNA puhastuskomplektidega.

    A-3 Mg2+ kontsentratsioon

    - Mg2+ kontsentratsioon on liiga kõrge - vähendage õigesti Mg2+ kontsentratsioon: optimeerige Mg2+ kontsentratsioon reaktsioonide seeriaga vahemikus 1 mM kuni 3 mM intervalliga 0,5 mM, et määrata optimaalne Mg2+ kontsentratsioon iga malli ja praimeri kohta.

    A-4 dNTP

    —— dNTP -de kontsentratsioon on liiga kõrge —– vähendage sobivalt dNTP kontsentratsiooni

    A-5 Lõõmutustemperatuur

    ——Liiga madal lõõmutamistemperatuur —– Tõsta lõõmutustemperatuuri sobivalt

    A-6 tsüklit

    —— Liiga palju tsükleid —— Optimeerige tsükli arvu

    K: Kui palju matriitsi DNA -d tuleks lisada 50 μl PCR reaktsioonisüsteemi?
    ytry
    K: Kuidas pikki fragmente võimendada?

    Esimene samm on valida sobiv polümeraas. Tavalist Taq polümeraasi ei saa korrigeerida 3'-5 'eksonukleaasi aktiivsuse puudumise tõttu ja mittevastavus vähendab tunduvalt fragmentide pikendamise efektiivsust. Seetõttu ei saa tavaline Taq polümeraas tõhusalt võimendada sihtfragmente, mis on suuremad kui 5 kb. Pikendamise efektiivsuse parandamiseks ja pika fragmendi võimendamise vajaduste rahuldamiseks tuleks valida spetsiaalse modifikatsiooniga Taq polümeraas või muu kõrge täpsusega polümeraas. Lisaks nõuab pikkade fragmentide võimendamine ka praimeri konstruktsiooni, denatureerimisaja, pikendamisaja, puhvri pH jms kohandamist. Tavaliselt võivad parema saagikusega kaasa tuua praimerid 18-24 bp. Malli kahjustuste vältimiseks tuleks denatureerimisaega 94 ° C juures lühendada 30 sekundini või vähem tsükli kohta ja temperatuuri tõusu aega 94 ° C -ni enne amplifikatsiooni vähem kui 1 minut. Veelgi enam, pikendustemperatuuri seadmine umbes 68 ° C ja pikendamisaja kavandamine vastavalt kiirusele 1 kb/min võib tagada pikkade fragmentide tõhusa amplifikatsiooni.

    K: Kuidas parandada PCR amplifikatsiooni täpsust?

    PCR -i amplifikatsiooni veamäära saab vähendada, kasutades erinevaid suure täpsusega DNA polümeraase. Kõigi seni leitud Taq DNA polümeraaside hulgas on Pfu ensüümil madalaim veamäär ja kõrgeim täpsus (vt lisatud tabelit). Lisaks ensüümide valikule saavad teadlased PCR -i mutatsioonikiirust veelgi vähendada, optimeerides reaktsioonitingimusi, sealhulgas puhvri koostise, termostabiilse polümeraasi kontsentratsiooni ja PCR -tsükli arvu optimeerimist.

    Kirjutage oma sõnum siia ja saatke see meile