2 × Taq Platinum PCR segu
Tegevuse määratlus
1 ühik (U) Taq plaatina DNA polümeraasi aktiivsust määratletakse ensüümikogusena, mis on vajalik 10 nmol deoksünukleotiidide lisamiseks happes lahustumatutesse ainetesse 74 ° C juures 30 minuti jooksul, kasutades matriitsi/praimerina lõhe sperma aktiveeritud DNA-d.
Kvaliteedi kontroll
Puhtus SDS-PAGE tuvastamisel on üle 99%; Eksogeense nukleaasi aktiivsust ei tuvastata; Ühe koopia geeni inimese genoomis saab tõhusalt amplifitseerida; Nädala jooksul toatemperatuuril hoides ei muutu aktiivsus oluliselt.
Peamised tehnilised parameetrid
Sellel on 5'-3 'eksonukleaasi aktiivsus ja 3'-5' eksonukleaasi aktiivsus ning selle täpsus on Pfu polümeraasi kõrval. Taq Platinum Polymerase pikendamiskiirus on kiirem kui Pfu polümeraas ja võimendusefektiivsus on suurem. PCR saadusi saab otse nüri otsa ligeerida või kloonida TA vektoriga. Kui kloonimise efektiivsust on vaja parandada, on soovitatav enne TA vektorisse kloonimist kõigepealt puhastada ja lisada 3'-dA üleulatuvad osad.
Ühe toruga Taq Platinum MasterMix (riiklik kõrgtehnoloogiline toote sertifikaat)
■ Taq Platinum MasterMix on parandanud PCR -reaktsiooni spetsiifilisust ja tundlikkust ning suudab võimendada keerulisi malle, millel on kõrge GC -sisaldus, sekundaarne struktuur jms. Sihtmallist saab võimendada kuni 2 eksemplari, tagades täpsemad katsetulemused.
■ Ainulaadne Taq Platinum MasterMix valem muudab kogu reaktsioonisüsteemi väga stabiilseks ning aktiivsust ei mõjuta korduv külmutamine-sulatamine ega pikaajaline säilitamine temperatuuril 4 ° C.
■ Stabiilne ja tõhus eelnevalt ettevalmistatud PCR segalahus võib muuta toimingu kiireks ja lihtsaks, vähendades oluliselt töömahukust ja proovivõtmisviga. Segusse on lisatud ka suure jõudlusega PCR-i võimendaja ja optimeerija, mis vähendab nõudeid PCR-tingimustele.
■ Sellel tootel on nii värve sisaldavad kui ka värvained. Värvaineid sisaldavaid MasterMix tooteid saab pärast PCR-i otse elektroforeesida ilma laadimispuhvrit lisamata.
Rakendused
See võib asendada Pfu polümeraasi, et võimendada kõrgetasemelisi tooteid keerukatest mallidest, nagu genoomid, ja see sobib selliste rakenduste jaoks nagu ekspressioonigeenide kloonimine, kohaspetsiifilised mutatsioonid ja ühe nukleotiidi polümorfismi (SNP) analüüs jne.
Ettevaatusabinõud PCR -praimerite kavandamisel:
Praimeri pikkus on tavaliselt 20-25 mer. Pika fragmendi PCR-i tegemisel tuleks praimeri pikkust suurendada 30-35 meerini.
■ Kahe praimeri vahel puudub täiendav sidumine, eriti 3 'otsa 3 viimase aluse puhul.
■ GC sisaldus peaks olema 50–60%ja vältige kohalikku rikkalikku GC-d või AT-d. Selleks, et praimer ja mall püsivalt siduda, vältige AT -rikka struktuuri 3 'otsas.
■ Vältige praimerit sekundaarse struktuuri moodustamiseks.
■ Valige kaks praimerit, mille Tm temperatuur on üksteise lähedal.
Praimerite Tm väärtuse arvutamine PCR jaoks:
■ Kui praimer on alla 20 mer: Tm = 2 ° C × (A+T)+4 ° C × (G+C).
■ Kui praimer on üle 20 mer: Tm = 81,5+0,41 × (GC%)-600/L, kus L on praimeri pikkus.
■ Seadke lõõmutamistemperatuur (Tm-5) ° C.
PCR praimeri sisend
Praimerite sobiva lõppkontsentratsiooni saab valida vahemikus 0,1 μM kuni 1,0 μM. Liiga madal praimeri kontsentratsioon toob kaasa amplifikatsioonisaaduste madala saagise, samas kui liiga kõrge praimeri kontsentratsioon on mittespetsiifilise amplifikatsiooni suhtes altim. Tavaliselt, kui matriits -DNA kogus on suur või matriitsina kasutatakse keerulist matriits -DNA -d (näiteks inimese genoomi DNA), peaks praimeri kontsentratsioon olema väiksem. Kui matriits -DNA kogus on väike või matriitsina kasutatakse lihtsat matriits -DNA -d (nt plasmiid -DNA jne), peaks praimeri kontsentratsioon olema suurem.
Kõiki tooteid saab kohandada ODM/OEM jaoks. Üksikasjade saamisekspalun klõpsake Kohandatud teenus (ODM/OEM)
  |
1 kb fragmendi võimendamiseks kasutage mallina genoomset DNA -d. Pärast PCR reaktsiooni võtke elektroforeesi tuvastamiseks 5 μl. |
A-1 mall
■ Mall sisaldab valgu lisandeid või Taq inhibiitoreid jne - puhastage DNA matriits, eemaldage valgu lisandid või ekstraheerige matriitsi DNA puhastuskomplektidega.
■ Malli denatureerimine pole lõpule viidud - suurendage sobivalt denatureerimise temperatuuri ja pikendage denatureerimisaega.
■ Malli halvenemine-valmistage mall uuesti ette.
A-2 Primer
■ Praimerite halb kvaliteet-sünteesige praimer uuesti.
■ Praimeri lagunemine - säilitamiseks salvestage kõrge kontsentratsiooniga praimerid väikesesse kogusse. Vältige mitmekordset külmutamist ja sulatamist või pikaajalist külmumist 4 ° C juures.
■ Praimerite vale disain (nt praimeri pikkus ei ole piisav, praimerite vahele on tekkinud dimeer jne) -Praimerite ümberkujundamine (vältige praimeri dimeeri ja sekundaarse struktuuri teket)
A-3 Mg2+kontsentratsioon
■ Mg2+ kontsentratsioon on liiga madal - suurendage korralikult Mg2+ kontsentratsioon: optimeerige Mg2+ kontsentratsioon reaktsioonide seeriaga vahemikus 1 mM kuni 3 mM intervalliga 0,5 mM, et määrata optimaalne Mg2+ kontsentratsioon iga malli ja praimeri kohta.
A-4 Lõõmutustemperatuur
■ Kõrge lõõmutamistemperatuur mõjutab praimeri ja matriitsi sidumist. —–Alandage lõõmutamistemperatuuri ja optimeerige seisundit 2 ° C gradiendiga.
A-5 Pikendusaeg
■ Lühike pikendusaeg - pikendamisaja pikendamine.
Nähtused: Negatiivsed proovid näitavad ka sihtjärjestuse ribasid.
A-1 PCR-i saastumine
■ Sihtjärjestuse või amplifikatsiooniproduktide ristsaastumine - Ärge püüdke sihtmärkjärjestust sisaldavat proovi pipeteerida negatiivse prooviga ega valage seda tsentrifuugitorust välja. Reaktiivid või seadmed tuleks autoklaavida olemasolevate nukleiinhapete kõrvaldamiseks ja saastumise olemasolu tuleks kindlaks teha negatiivsete kontrollkatsete abil.
■ Reagendi saastumine ——Alkoteerige reaktiivid ja hoidke madalal temperatuuril.
A-2 Primer
■ Mg2+ kontsentratsioon on liiga madal - suurendage korralikult Mg2+ kontsentratsioon: optimeerige Mg2+ kontsentratsioon reaktsioonide seeriaga vahemikus 1 mM kuni 3 mM intervalliga 0,5 mM, et määrata optimaalne Mg2+ kontsentratsioon iga malli ja praimeri kohta.
■ Ebaõige praimeri disain ja sihtjärjestus on homoloogia mittesihtjärjestusega. ——Projektide ümberkujundamine.
Nähtused: PCR-i amplifikatsiooniribad on vastuolus eeldatava suurusega, kas suured või väikesed, või mõnikord esinevad nii spetsiifilised võimendusribad kui ka mittespetsiifilised amplifikatsiooniribad.
A-1 Primer
■ Praimeri halb spetsiifilisus
——Re-design primer.
■ Praimeri kontsentratsioon on liiga kõrge - suurendage denatureerimise temperatuuri ja pikendage denatureerimisaega.
A-2 Mg2+ kontsentratsioon
■ Mg2+ kontsentratsioon on liiga kõrge - vähendage õigesti Mg2+ kontsentratsiooni: optimeerige Mg2+ kontsentratsioon reaktsioonide seeriaga vahemikus 1 mM kuni 3 mM intervalliga 0,5 mM, et määrata optimaalne Mg2+ kontsentratsioon iga malli ja praimeri kohta.
A-3 Termostabiilne polümeraas
■ Liiga suur ensüümikogus - vähendage ensüümi kogust sobivalt 0,5 Ü intervalliga.
A-4 Lõõmutustemperatuur
■ Lõõmutamistemperatuur on liiga madal-suurendage sobivalt lõõmutamistemperatuuri või kasutage kaheastmelist lõõmutusmeetodit
A-5 PCR tsüklit
■ Liiga palju PCR -tsükleid - vähendage PCR -tsüklite arvu.
A-1 Primer—— Halb spetsiifilisus —— Kavandage praimer uuesti, muutke praimeri asukohta ja pikkust, et suurendada selle spetsiifilisust; või teha pesastatud PCR.
A-2 malli DNA
——Mall ei ole puhas —— Puhastage mall või ekstraheerige DNA puhastuskomplektidega.
A-3 Mg2+ kontsentratsioon
- Mg2+ kontsentratsioon on liiga kõrge - vähendage õigesti Mg2+ kontsentratsioon: optimeerige Mg2+ kontsentratsioon reaktsioonide seeriaga vahemikus 1 mM kuni 3 mM intervalliga 0,5 mM, et määrata optimaalne Mg2+ kontsentratsioon iga malli ja praimeri kohta.
A-4 dNTP
—— dNTP -de kontsentratsioon on liiga kõrge —– vähendage sobivalt dNTP kontsentratsiooni
A-5 Lõõmutustemperatuur
——Liiga madal lõõmutamistemperatuur —– Tõsta lõõmutustemperatuuri sobivalt
A-6 tsüklit
—— Liiga palju tsükleid —— Optimeerige tsükli arvu
Esimene samm on valida sobiv polümeraas. Tavalist Taq polümeraasi ei saa korrigeerida 3'-5 'eksonukleaasi aktiivsuse puudumise tõttu ja mittevastavus vähendab tunduvalt fragmentide pikendamise efektiivsust. Seetõttu ei saa tavaline Taq polümeraas tõhusalt võimendada sihtfragmente, mis on suuremad kui 5 kb. Pikendamise efektiivsuse parandamiseks ja pika fragmendi võimendamise vajaduste rahuldamiseks tuleks valida spetsiaalse modifikatsiooniga Taq polümeraas või muu kõrge täpsusega polümeraas. Lisaks nõuab pikkade fragmentide võimendamine ka praimeri konstruktsiooni, denatureerimisaja, pikendamisaja, puhvri pH jms kohandamist. Tavaliselt võivad parema saagikusega kaasa tuua praimerid 18-24 bp. Malli kahjustuste vältimiseks tuleks denatureerimisaega 94 ° C juures lühendada 30 sekundini või vähem tsükli kohta ja temperatuuri tõusu aega 94 ° C -ni enne amplifikatsiooni vähem kui 1 minut. Veelgi enam, pikendustemperatuuri seadmine umbes 68 ° C ja pikendamisaja kavandamine vastavalt kiirusele 1 kb/min võib tagada pikkade fragmentide tõhusa amplifikatsiooni.
PCR -i amplifikatsiooni veamäära saab vähendada, kasutades erinevaid suure täpsusega DNA polümeraase. Kõigi seni leitud Taq DNA polümeraaside hulgas on Pfu ensüümil madalaim veamäär ja kõrgeim täpsus (vt lisatud tabelit). Lisaks ensüümide valikule saavad teadlased PCR -i mutatsioonikiirust veelgi vähendada, optimeerides reaktsioonitingimusi, sealhulgas puhvri koostise, termostabiilse polümeraasi kontsentratsiooni ja PCR -tsükli arvu optimeerimist.
Toote kategooriad
MIKS VALIDA MEID
Alates selle loomisest on meie tehas arendanud esmaklassilisi tooteid, järgides põhimõtet
kõigepealt kvaliteet. Meie tooted on saavutanud suurepärase maine tööstuses ja väärtuslikkuse uute ja vanade klientide seas.
- Tel: +86 010-59822688
- Hoone 5, nr 86, Shuangying West Road, Changpingi piirkond, Peking.
- people@tiangen.com
